Développement d’outils de détection et de contrôle de viabilité du nématode des tiges, Ditylenchus dipsaci, sur semences de luzerne (Medicago sativa L.).

26 Juin 18 Image

Développement d’outils de détection et de contrôle de viabilité du nématode des tiges, Ditylenchus dipsaci, sur semences de luzerne (Medicago sativa L.).

Le GEVES a développé une nouvelle méthode de détection de Ditylenchus dipsaci sur semences de luzerne, par PCR en temps réel ainsi qu’un nouveau test de confirmation de la viabilité des nématodes isolés. Ces méthodes ont été validées dans le cadre du projet Dityluz financé par CASDAR, en partenariat avec l’ANSES, l’UFS, la FNAMS et l’ANSES-LSV.

Désormais LNR en santé des végétaux sur ORNQ (Organisme Réglementé Non Quarantaine), le GEVES a proposé à l’officialisation cette méthode au ministère en charge de l’Agriculture. Celle-ci a été officialisée au Bulletin Officiel du ministère en Novembre 2020. Elle est désormais appliquée au GEVES.

Le nématode des tiges, Ditylenchus dipsaci, est une menace pour la production de semences de luzerne. D. dipsaci est classé depuis Décembre 2019 comme ORNQ (Organisme Réglementé Non-Quarantaine) sur les semences de luzerne selon le règlement 2016/2031 du parlement européen et du conseil, listé dans l’annexe IV partie A du règlement (UE) 2019/2072. Seules les semences exemptes de nématodes peuvent être commercialisées. Or, la viabilité des nématodes qui est pourtant essentielle dans la lutte contre ce bioagresseur, n’était jusqu’ici pas prise en compte. Les lots de semences étaient considérés comme positifs bien que tous les nématodes soient morts et ne présentent plus aucun risque pour la culture. L’application de techniques de traitement alternatives n’était alors pas valorisée.

Le projet Dityluz (subventionné CASDAR) a été mis en œuvre dans le cadre d’un partenariat multilatéral innovant impliquant les partenaires du secteur semencier (UFS et GNIS) et de la recherche publique (ANSES et GEVES Laboratoire de pathologie et BioGEVES) ainsi que des experts scientifiques et techniques (INRA et FNAMS). Utilisant une diversité de techniques (biologie moléculaire, morphobiométrie, coloration…), le projet Dityluz a permis le développement d’outils de détection et de différenciation de D. dipsaci vivants/morts dans les lots de semences. Une méthode de détection dans des extraits de semences par PCR (SE-PCR) a été mise au point, basée sur différents principes: la concentration de la population de nématodes par lavage de semences, l’extraction de l’ADN et la PCR en temps réel.

Fig 2. Dépôt d’ADN et lancement de la qPCR pour détecter la présence de D. dipsaci par SE-PCR

 

La méthode a été validée dans un ring test et les critères de performance évalués : le seuil de détection (sensibilité analytique) a été déterminé à un seul D. dipsaci, la sensibilité, la spécificité ainsi que la répétabilité et la reproductibilité ont été déterminées à 100%. Cette méthode, à plus haut débit que la méthode classique basée sur l’observation des nématodes extraits, permet un gain de temps et de capacité d’analyse des lots de luzerne, passant de 60 échantillons à 100 échantillons par semaine, favorisant une libération plus rapide des lots.

 

Pour évaluer la viabilité de D. dipsaci, une méthode de coloration a été développée et validée. Elle permet de s’assurer de l’efficacité des méthodes de traitement alternatives.

 

Fig 3. D. dipsaci mort (coloré en rouge) et vivant (incolore) après test de viabilité par coloration

Les résultats de ce projet ont été communiqués aux entreprises semencières et au Service Officiel de Contrôle à travers l’organisation d’un workshop. Ces nouveaux outils pourraient être développées sur d’autres espèces de semences.

Les résultats du projet Dityluz pourront être exploités pour améliorer les mesures opérationnelles du système de certification des lots de semences de luzerne.

Cette nouvelle méthode est mise en œuvre dans le cadre de la certification des semences et disponible dans la gamme des prestations proposées par le GEVES.

ORGEUR G. et BALDWIN T.K.

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